编者按

在美国，胰腺导管癌（PDAC）是第四致死癌症，有癌王之称。大规模基因组研究表明在超过90%的PDAC患者中，都存在着KRAS突变。大量的研究表明KRAS突变在癌症的起始以及进展过程中发挥重要作用，导致癌症的增生、迁移、转化、逃避肿瘤免疫反应以及细胞代谢重编程。 

在PDAC中，KRAS蛋白的12号氨基酸最常突变的位点，其中以KRASG12D突变类型最为常见，其次是KRSAG12V。目前针对KRAS突变靶点的药物甚少，主要的药物靶向策略是设计选择性共价抑制剂，其通过与激活状态的KRAS以及青环素A之间形成稳定的、高亲和力的复合物达到抑制效果，但这些药物都尚未使用等基因癌症模型进行验证，对PDAC患者的治疗效果未可知，因此需要寻找新的新的治疗策略以及药物。

今天，我们特别关注美国康奈尔医学院陈水冰教授、Todd Evans教授团队于2023年12月26日发表在《Cell Stem Cell》（IF：23.9）的经典研究——A pancreatic cancer organoid platform identifies an inhibitor specific to mutant KRAS，该研究通过CRISPR/Cas9的技术构建等基因突变胰腺类器官，利用胰腺类器官进行高通量药物筛选研究，最终鉴定出了Perhexiline maleate（马来酸派克西林），它可以在体外以及体内一直携带KRAS突变的胰腺癌类器官以及原代人PDAC类器官的生长并诱导细胞凋亡。同时，研究者发现胆固醇合成在KRAS突变的类器官中特异性上调，Perhexiline maleate可以降低SREBP2的表达水平，从而发挥对KRAS突变体的抑制作用。这一研究为筛选胰腺癌的靶向抑制剂提供了新的研究工具。

论文翻译：唐为东

01、主要研究成果

1、四种等基因突变胰腺类器官构建

研究者采用CRISPR/Cas9的技术构建了四种等基因突变胰腺类器官（KC/KPC/KSC/KPSC），然后采用单细胞测序技术对构建的胰腺类器官进行转录组分析，探究突变引起的转录组变化。

通过无监督数据分析和条形码投影识别的细胞簇匹配良好，这表明细胞簇的基因特征主要受基因型影响。研究者进一步研究了胰腺细胞谱系的转录因子谱，包括导管谱系、外分泌谱系以及内分泌谱系。

结果发现构建的突变胰腺类器官主要是胆管来源的。临床上PDAC主要分为两种亚型：经典样亚型以及基底样亚型，研究者进一步探究了构建类器官所属亚型，结果发现在KPC以及KPSC类器官中，经典样亚型以及基底样亚型共存，而KSC类器官主要以基底样亚型为主。以上结果表明，等基因突变的胰腺类器官具备胰腺癌相关的表型。

图1 

2、建立高通量药物筛选平台，以找到潜在靶向KRAS突变的抑制剂

为了找到潜在靶向KRAS突变的抑制剂，研究者建立了一个高通量药物筛选平台。首先将四种突变类器官接种于384孔板中，然后给予6000种FDA批准的药物、信号通路抑制剂以及天然产物，给药48 h后，采用alamaBlue分析细胞活性，筛选出60种潜在靶向抑制剂。

进一步研究者利用CellTiter-Glo分析细胞死活，从60种抑制剂中筛选出49种抑制剂，其中23种具有量效曲线，进一步发现四个具有良好剂量依赖性以及低毒性的化合物：phehexiline maleate（马来酸派克西林）、gentian violet（结晶紫）、clotrimazol（克霉唑）以及lestaurtinib（来他替尼）。其中结晶紫和克霉唑因为缺乏药效药动数据而不能进行体内分析，而来他替尼在治疗PDAC的临床试验中宣告失败，因此研究者将重点聚焦于phehexiline maleate（马来酸派克西林）上。

图2

3、明确phehexiline maleate（马来酸派克西林）药效

为了进一步明确phehexiline maleate（马来酸派克西林）的药效，研究者首先在体外给予类器官phehexiline maleate（马来酸派克西林），结果发现突变类器官出现显著死亡，而对照组类器官正常生长，同时免疫荧光结果发现phehexiline maleate（马来酸派克西林）能显著下调类器官Ki67的表达以及上调Caspase-3的表达。

接着，研究者利用小鼠原位移植模型探讨phehexiline maleate（马来酸派克西林）的体内药效，结果表明phehexiline maleate（马来酸派克西林）能明显抑制肿瘤的生长，以上结果表明phehexiline maleate（马来酸派克西林）在体内/体外胰腺癌类器官模型中，可以抑制细胞生长以及诱导细胞凋亡。

图3

研究者进一步利用PDAC患者来源的胰腺癌类器官来验证phehexiline maleate（马来酸派克西林）的药效，结果发现phehexiline maleate（马来酸派克西林）能明显抑制类器官的生长，同时下调Ki67的表达以及上调Caspase-3的表达，以上结果表明phehexiline maleate（马来酸派克西林）可以抑制PDAC类器官的生长以及诱导细胞凋亡。

图4

4、进一步探究phehexiline maleate作用机制

为了探究phehexiline maleate（马来酸派克西林）作用的机制，研究者利用基因表达差异分析以及单细胞测序，发现phehexiline maleate（马来酸派克西林）可以下调胆固醇生物合成以及代谢途径相关基因的表达，表达phehexiline maleate（马来酸派克西林）可能是通过抑制胆固醇的合成通路从而发挥药效。

图5

5、突变类器官中Srebf2的作用机制研究

研究表明由Srebf2基因编码的SREBP2蛋白是一个转录因子，通过控制参与胆固醇合成以及摄取的酶从而调控胆固醇稳态。SREBP2提高了胆固醇合成相关基因的表达，为癌细胞的生长提供有利环境，是胶质母细胞瘤、结肠癌以及肝癌的主要驱动因素。

因此，作者想探究phehexiline maleate（马来酸派克西林）调节胆固醇生物合成的效应是否是因为通过调节SREBP2介导的胆固醇生物合成从而发挥作用的。研究者首先发现在突变类器官中Srebf2以及胆固醇摄取基因Ldlr的表达明显上调，而phehexiline maleate（马来酸派克西林）可以明显抑制Srebf2以及胆固醇合成摄取相关基因的表达。研究者进一步通过化学小分子的手段（Betulin）来抑制SREBP2成熟，结果发现Betulin能显著抑制肿瘤的生长。

图6

研究者进一步通过遗传学手段，利用shRNA下调Srebf2的表达，结果发现下调Srebf2能显著抑制胆固醇生物合成相关基因的表达以及肿瘤的生长，表明SREBP2是胰腺癌治疗的潜在靶点。

图7

02、编者点评

综上所述，研究者利用等基因胰腺类器官进行了高通量药物筛选，鉴定出了phehexiline maleate（马来酸派克西林），它可以在体内和体外抑制KRAS突变的胰腺类器官以及人原代PDAC类器官的生长并诱导凋亡。同时研究者发现胆固醇合成在KRAS突变的类器官中特异性上调，Perhexiline maleate可以降低SREBP2的表达水平，从而发挥对KRAS突变体的抑制作用。这一研究为筛选胰腺癌的靶向抑制剂提供了新的研究工具。

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