编者按

了解基因组的每个基因在胚胎发育过程中对个体表型的贡献，是发育遗传学的基本目标。单细胞RNA测序(scRNA-seq)技术的成熟，使全胚胎细胞图谱的建立成为可能。然而，这些数据大多是从野生型胚胎中收集的，并未对发育过程中存在的潜在变异进行评估。

生命发育基因能否像代码一样被"逆向编译"？美国华盛顿大学发表在Nature的一项研究，在斑马鱼胚胎中首次实现全胚胎尺度、单细胞精度的反向遗传操作，并构建了"受干扰胚胎的斑马鱼单细胞图谱"(ZSCAPE)。

通过利用斑马鱼Crispant技术（斑马鱼Crispant技术：基因功能研究新范式）、高通量单细胞核RNA测序及Sci-Plex多重标记等技术，鉴定出33种主要组织中的99种细胞类型、156种细胞亚型，实现了对大量个体胚胎单细胞水平的全面分析，为大规模、高通量的胚胎发育及基因功能研究铺平了道路，将加快对胚胎发育的研究，并促进对特定基因突变如何影响整个胚胎中的细胞而致病机制的理解。

01、研究概述

本研究中构建了“受干扰胚胎的斑马鱼单细胞图谱”，收集了1812个单独解析发育中的斑马鱼类胚胎的单细胞转录组数据，包括19个时间点、23个遗传干扰和3.2 百万个细胞。这一研究中的高度复制（每个条件下有八个或更多胚胎）使研究人员能够评估整个生物体内细胞类型丰度的变化，并检测细胞类型组成相对于野生型胚胎的扰动依赖性偏差。这一方法对罕见的细胞类型很敏感，可以解析脑神经节神经元的发育轨迹和遗传依赖性，脑神经节神经元是一个占胚胎不到1%的细胞群体。

此外，对单个突变体的时间序列分析发现了一组与脊索鞘细胞具有惊人相似转录组的短距离独立细胞，这导致了关于头骨早期起源的新假设。研究人员预计，从大量个体胚胎中标准化收集高分辨率、生物体规模的单细胞数据，将有助于绘制斑马鱼细胞类型的遗传依赖性，同时也解决发育遗传学中的长期挑战，包括个体表型多样性背后的细胞和转录可塑性。

02、主要研究成果

1. ScEdiT单细胞编辑追踪技术的革命性突破

本研究通过Sci-Plex多重标记技术、CRISPR-cas9基因编辑技术和单细胞转录组测序（sci-RNA-seq3）技术等整合，首创了ScEdiT单细胞编辑追踪技术平台，为大规模、高通量的胚胎发育研究铺平了道路。

Sci-Plex多重标记技术，可以将不同样本中的细胞或细胞核“散列”标记组合，实现细胞溯源，对多个个体同时进行分析；利用斑马鱼Crispant技术（斑马鱼Crispant技术：基因功能研究新范式）可以在胚胎早期阶段（F0）产生高效突变体，实现程序化、高效的基因编辑，彻底绕开了传统方法需要几代才能获得稳定突变体的漫长周期；单细胞转录组测序技术可以一次对数百万个细胞核转录组进行分析，实现胚胎的规模检测，并动态追踪其变化，大大提高了实验效率。

2. 建立ZSCAPE斑马鱼单细胞图谱

本研究构建了ZSCAPE“受干扰胚胎的斑马鱼单细胞图谱”，收集了1812个单独解析发育中的斑马鱼类胚胎的单细胞转录组数据，包括19个时间点、23个遗传干扰和320 万个单细胞转录组。在每个时间点，研究人员收集了48—140个胚胎，在四个单细胞组合索引RNA测序（sci-RNA-seq3）实验中，进行约17000-231000个高质量细胞的单核转录组。尽管在不同平台上收集而来，但这些数据与早期斑马鱼scRNA-seq数据相一致。

总体而言，研究人员将细胞分为33种主要组织、99种广泛的细胞类型和156种细胞亚型。

图片图1 斑马鱼单细胞图

3. 基于斑马鱼crispant技术进行胚胎高分辨率的表型分析

随后，研究人员基于斑马鱼Crispant技术、Sci-Plex标记分析了由CRISPR–Cas9突变产生的斑马鱼F0敲除物在发育过程中的细胞组成变化和单细胞遗传扰动。通过靶向量化23个基因扰动导致的102种细胞丰度变化，如noto敲除减少脊索细胞、增加底板细胞，发现中脑神经前体细胞中，cdx4敲除导致hoxb3a/hoxc3a/hoxc6b这3个Hox基因显著下调；最后一组的gRNA能够在F0期敲除后产生预期表型，且不影响细胞存活。

接着，研究人员鉴定出了多种显著差异丰度的细胞类型(DACTs)。例如，调控早期体节谱系的转录因子Tbx16,Msgn1,Tbx16的突变体crispants表现出一致且显著的细胞类型丰度变化，这些转录因子共同调控神经中胚层祖细胞（NMPS）向中胚层祖细胞（MPCs）和脊髓后祖细胞（pSPCs）的分化。数据显示，在这些基因突变体中，MPC和pSPC谱系均逐渐增多，揭示了这些因子对两种谱系的协同控制作用。

图片图2 斑马鱼胚胎的高分辨率表型

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03、编者点评

      本研究构建了“斑马鱼胚胎扰动单细胞图谱”（ZSCAPE），并首次实现了基因扰动与全胚胎细胞表型的动态关联，通过标准化胚胎尺度单细胞分析，将反向遗传学推入“全胚胎+单细胞+时序”三维时代，为构建遗传依赖全景图谱、解析复杂表型的非编码调控机制，从而推动精准医疗的胚胎尺度建模开辟了新路径。

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