增强免疫力 实验方案

一、实验动物

品系：C57BL/6小鼠 

性别：雄性

年龄：6-8周龄

二、实验分组

1）正常对照组：空白对照

2）阳性对照组：客户提供

3）低剂量组：低剂量的受试样品（参考值：人体服用量5倍）

4）中剂量组：中剂量的受试样品（参考值：人体服用量10倍）

5）高剂量组：高剂量的受试样品（参考值：人体服用量20倍）

三、实验方法

1）适应环境后，各组小鼠按上述安排入组。

2）按上述分组给予受试样品灌胃，每日1次，共28天。

四、检测指标

细胞免疫

1）脾脏淋巴细胞转化实验

受试样品给予完成后，处死小鼠取脾脏

制备3x106个/ml脾脏细胞悬液，每个样本分2孔，以每孔1ml悬液加入24孔板中，随后一孔加入75ulConA液，另一孔做对照。培养72小时后用MTT法测定OD570，并以OD570差值计算淋巴细胞增值能力指数。

2）迟发型超敏实验（足跖增厚法）

受试样品给予完成后，给予各组小鼠腹腔注射0.2ml的2%压积绵羊血红细胞（SRBC），然后继续灌胃受试样品4天

灌胃4天后测量左后足跖厚度，并在测量部位皮下注射20ul的20% 压积SRBC。

注射后24h测量同一位部位的足跖厚度差值（足跖肿胀度）

体液免疫

1）溶血素实验

受试样品给予完成后，给予各组小鼠腹腔注射0.2ml的2%压积绵羊血红细胞（SRBC），然后继续灌胃受试样品5天

灌胃5天后，各组小鼠眼球取血并收集血清。

用生理盐水将血清作倍比稀释（12次），分别加入0.5%SRBC悬液100 u l

混匀,置湿盒37℃ 3h后观察结果,记录每孔的凝集程度。计算抗体积数。

单核/巨噬细胞功能

1）碳廓清实验

受试样品给予完成后，各组小鼠尾静脉注射用4倍生理盐水稀释的墨汁，按0.lml/10g墨汁注入后立即计时。

于注入墨汁后第2、10min分别从内眦静脉丛取血20 ul,加到2ml碳酸钠溶液中,以碳酸钠溶液作空白对照测量各样本的OD600。

完成后处死小鼠取肝、脾称重并按如下公式计算吞噬指数α：

吞噬指数α = 体重/（肝重+脾重）x K1/3

K = (lgOD6002min-lgOD60010min)/8

2）腹腔巨噬细胞吞噬实验(半体内法)

受试样品给予完成后，各组小鼠腹腔注射20%的鸡红细胞悬液1ml。

30分钟后断颈处死，将其固定在鼠板上,正中剪开腹壁皮肤,经腹腔注入生理盐水2ml，转动鼠板1分钟,吸出腹腔洗液1ml，平均滴于2张载玻片上,置湿盒37℃ 30分钟。

取出在生理盐水漂洗、晾干、固定后用4% Giemsa的PBS溶液染色3分钟后镜检计算吞噬百分率。

NK 细胞活性测定

1）NK 细胞活性测定

受试样品给予完成后，处死小鼠取脾脏

制备脾脏细胞悬液，每组重复3次，试剂盒检测乳酸脱氢酶（LDH）活性。

上述每个实验需要最少一组10只，其中，脾脏淋巴细胞转化实验（细胞免疫）可以和NK细胞活性测定实验合并一起做，迟发型超敏实验（细胞免疫）可以与溶血素实验（体液免疫）合并一起做。

五、判断标准

细胞免疫，体液免疫，单核-巨噬细胞功能，NK细胞活性四项中任意两项结果阳性即可评价为具备增强免疫力。

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