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（一）SASP
【评价原理】
皮肤衰老是个复杂的过程，其伴随着含水量降低，新陈代谢减慢，免疫力下降等多个过程，皮肤衰老的特征是失去弹性、松弛、出现皱纹和粗糙的外观等。但是，衰老(senescence)是生物体组织、器官以及细胞的功能随时间而逐渐丧失的渐进过程。通过连续培养人二倍体细胞的方法得到衰老细胞模型即复制性衰老，耗时较长，很难在短期时间内获得大量背景一致的衰老细胞群体，因此给衰老相关的科学研究带来很多困难。在应用于衰老过程的临床前沿医学研究的细胞模型中，人角质形成细胞和成纤维细胞是最常用的细胞模型。到目前为止，大多学者都采用紫外线辐射诱导细胞提前衰老模型。由于 UVB 辐射诱导细胞早衰模型符合日光照射引起细胞衰老的特点，已被广泛应用于抗衰老药物的筛选和潜在药理机制的研究。
本研究拟用 UVB 辐射成纤维细胞以建立 UVB 所致成纤维细胞 提前衰老模型，以待测样品为干预因素，检测衰老相关分泌表型(SASP)的表达（IL6/TNFα/MMP3），以样品的抗衰老功效。
实验方案
实验一：MTT 法检测样品对成纤维细胞的细胞毒性实验
1）细胞接种：接种细胞于 96孔板内（1× 10^4个/孔），于37 ℃，5%CO2中培养24 h。
2）给药：样品组加入相应浓度的含样品的培养基，正常对照组更换为新鲜培养基，空白组加入空白培养基，37 ℃，5% CO2孵育 24 h。
3）孵育结束后向每孔中加入 MTT 溶液，继续培养 4 h。
4）去培养液，加入 DMSO 溶液，振荡混匀，测定 490 nm 处吸光度值。
OD490：490 nm 处的吸光度值
实验二：样品对 UVB 老化处理后成纤维细胞的 SASP(IL6/TNFα/MMP3)表达量
1） 细胞接种：将成纤维细胞以 2 × 10^5 个/孔接种于 6 孔板，于培养箱（37℃、5%CO2）中培养 12 h，分别设置对照组（X mJ/cm2+0 mM 样品）、UVB 照射低浓度组（30 mJ/cm2+AmM 样品）、UVB 照射中浓度组（30 mJ/cm2 +B mM 样品）、UVB 照射高浓度组（30 mJ/cm2+ C mM 样品）。
2） UVB 老化处理：UVB 辐射前成纤维细胞用 D’Hanks 洗 3 遍，在孔中加入 1 mL D’Hanks，使之浸没细胞，对照组用锡纸包住置暗处。针对试验分组，对需要辐射的组分别进行UVB 造模（每天每次 10 mJ/cm2 共计 3 天连续处理）；
3） 给药：按照各试验组分组，每次照射完成后进行给药处理培养 24 h，共计 3 天 3 次；
4）收样：培养结束后，进行细胞收样，提取各实验组总 RNA，合成 cDNA，利用 q-PCR 检测β-actin 和目的基因的基因表达。
5）用β-actin 作为基因表达的内参，计算目的基因的 RNA 相对表达量。
注：本实验方法中的样品的浓度因实验一结果而定。
【评价指标】
衰老相关分泌表型(SASP)的表达（IL6/TNFα/MMP3。
【评价结论】
与模型对照组相比，实验组中衰老相关分泌表型(SASP)的表达（IL6/TNFα/MMP3）显著性下调（P＜0.05），初步证明样品具有抗衰老功效。
【参考文献】
[1]魏丽.柴达木黑果枸杞花青素对 UVB 辐射体外培养人皮肤成纤维细胞的衰老及 p53,p21影响的研究[D].青海大学
[2] Kulms D, Zeise E , P, Ppelmann B , et al. DNA damage, death receptor activation and reactive oxygen species contribute to ultraviolet radiation-induced apoptosis in an essential and independent way.[J]. Oncogene, 2002, 21(38): 5844-5851.
[3] 刘春显,李南.人参皂苷 Rb1 对人体皮肤成纤维细胞衰老的影响[J].人参研究, 2022,34(4):4.
[4] 林勇, 刘硕, 朱华伟,等. 红树莓对 UVB 诱导 HaCaT 光损伤的抑制作用[J]. 湖南农业大学学报(自科版), 2015, 041(005): 474-479.
[5] 冯丹, 刘婷, 李冠汝,等. 蒿秦化斑方对紫外线B诱导的HaCaT细胞光损伤的影响[J]. 环球中医药, 2020, 13(5): 6.
（二）MMP-2 、MMP-9、TIMP-1 和 TIMP-2 的表达
【评价原理】
已有大量的研究证明，紫外线照射后诱导人类皮肤成纤维细胞产生基质金属蛋白酶( MMPs) 增多，MMPs 降解胶原和细胞外基质蛋白，在皮肤光老化中起着重要作用。MMPs是一类含有锌离子、活性依赖于钙离子的蛋白酶，具有广泛的生物学活性。已知的 MMPs 成员有 24 种，主要可分为胶原酶 ( MMP-1，8，13 ) 、基质溶解素( MMP-3，7，10，11) 、明胶酶 ( MMP-2，9) 等亚家族，不同的 MMPs 对细胞外基质不同组分降解的特异性有所不同。人基质金属蛋白酶抑制剂（TIMPs）是 MMPs 天然的特异性内源性抑制剂，TIMPs 与MMPs 的精密平衡在 ECM 的合成和降解中发挥着重要作用，皮肤光老化是二者动态平衡失调的结果。因此，本研究拟用 UVB 辐射成纤维细胞以建立 UVB 所致成纤维细胞 提前衰老模型，通过样品作用于光老化的皮肤成纤维细胞后，检测 MMP-2 、MMP-9、TIMP-1和 TIMP-2 的表达来评价样品的抗衰老功效。
【实验方案】
实验一：MTT 法检测样品对成纤维细胞的细胞毒性实验
实验二：样品对 UVB 老化处理后成纤维细胞的 MMP-2 、MMP-9、TIMP-1 和TIMP-2 表达情况
1） 细胞接种：将成纤维细胞以 2 × 10^5 个/孔接种于 6 孔板，于培养箱（37℃、5%CO2）中培养 12 h，分别设置对照组（X mJ/cm2+0 mM 样品）、UVB 照射低浓度组（30 mJ/cm2+AmM 样品）、UVB 照射中浓度组（30 mJ/cm2 +B mM 样品）、UVB 照射高浓度组（30 mJ/cm2+ C mM 样品）。
2） UVB 老化处理：UVB 辐射前成纤维细胞用 D’Hanks 洗 3 遍，在孔中加入 1 mL D’Hanks，使之浸没细胞，对照组用锡纸包住置暗处。针对试验分组，对需要辐射的组分别进行UVB 造模（每天每次 10 mJ/cm2 共计 3 天连续处理）；
3） 给药：按照各试验组分组，每次照射完成后进行给药处理培养 24 h，共计 3 天 3 次；
4）收样：培养结束后，进行细胞收样，提取各实验组总 RNA，合成 cDNA，利用 q-PCR 检测β-actin 和目的基因的基因表达。
5）用β-actin 作为基因表达的内参，计算目的基因的 RNA 相对表达量。
注：本实验方法中的样品的浓度因实验一结果而定。
【评价指标】
MMP-2 、MMP-9、TIMP-1 和 TIMP-2 相对表达量
【评价结论】
与模型对照组相比，实验组中样品对衰老细胞的基质金属蛋白酶相关基因表达（MMP-2和 MMP-9）显著性下调、而其抑制基因（TIMP-1 和 TIMP-2）显著性上调（P＜0.05），初步证明样品具有抗衰老功效。
【参考文献】
[1] 殷珊.栀子黄色素对小鼠B16黑素瘤细胞增殖、酪氨酸酶活性及黑素生成影响的实验研究[D].湖南中医药大学.
[1]魏丽.柴达木黑果枸杞花青素对 UVB 辐射体外培养人皮肤成纤维细胞的衰老及 p53,p21影响的研究[D].青海大学
[2] Kulms D, Zeise E , P, Ppelmann B , et al. DNA damage, death receptor activation andreactive oxygen species contribute to ultraviolet radiation-induced apoptosis in an essential andindependent way.[J]. Oncogene, 2002, 21(38): 5844-5851.
[3] 刘春显,李南.人参皂苷 Rb1 对人体皮肤成纤维细胞衰老的影响[J].人参研究, 2022,34(4):4.
[4] 林勇, 刘硕, 朱华伟,等. 红树莓对 UVB 诱导 HaCaT 光损伤的抑制作用[J]. 湖南农业大学学报(自科版), 2015, 041(005): 474-479.
[5] 冯丹, 刘婷, 李冠汝,等. 蒿秦化斑方对紫外线B诱导的HaCaT细胞光损伤的影响[J]. 环球中医药, 2020, 13(5): 6.
[6]陈巧云,王业秋,陈景华,等.桃叶珊瑚苷对光老化皮肤成纤维细胞 MMP-1 和 TIMP-1 表达的影响[J].中成药, 2014, 36(8):5.
