利用细胞评价供试品抗衰老功效

(一)SASP 

【评价原理】

皮肤衰老是个复杂的过程,其伴随着含水量降低,新陈代谢减慢,免疫力下降等多个过程,皮肤衰老的特征是失去弹性、松弛、出现皱纹和粗糙的外观等。但是,衰老(senescence)是生物体组织、器官以及细胞的功能随时间而逐渐丧失的渐进过程。通过连续培养人二倍体细胞的方法得到衰老细胞模型即复制性衰老,耗时较长,很难在短期时间内获得大量背景一致的衰老细胞群体,因此给衰老相关的科学研究带来很多困难。在应用于衰老过程的临床前沿医学研究的细胞模型中,人角质形成细胞和成纤维细胞是最常用的细胞模型。到目前为止,大多学者都采用紫外线辐射诱导细胞提前衰老模型。由于 UVB 辐射诱导细胞早衰模型符合日光照射引起细胞衰老的特点,已被广泛应用于抗衰老药物的筛选和潜在药理机制的研究。

本研究拟用 UVB 辐射成纤维细胞以建立 UVB 所致成纤维细胞 提前衰老模型,以待测样品为干预因素,检测衰老相关分泌表型(SASP)的表达(IL6/TNFα/MMP3),以样品的抗衰老功效。

实验方案

实验一:MTT 法检测样品对成纤维细胞的细胞毒性实验

1)细胞接种:接种细胞于 96孔板内(1× 10^4个/孔),于37 ℃,5%CO2中培养24 h。

2)给药:样品组加入相应浓度的含样品的培养基,正常对照组更换为新鲜培养基,空白组加入空白培养基,37 ℃,5% CO2孵育 24 h。

3)孵育结束后向每孔中加入 MTT 溶液,继续培养 4 h。

4)去培养液,加入 DMSO 溶液,振荡混匀,测定 490 nm 处吸光度值。

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OD490:490 nm 处的吸光度值

实验二:样品对 UVB 老化处理后成纤维细胞的 SASP(IL6/TNFα/MMP3)表达量

1) 细胞接种:将成纤维细胞以 2 × 10^5 个/孔接种于 6 孔板,于培养箱(37℃、5%CO2)中培养 12 h,分别设置对照组(X mJ/cm2+0 mM 样品)、UVB 照射低浓度组(30 mJ/cm2+AmM 样品)、UVB 照射中浓度组(30 mJ/cm2 +B mM 样品)、UVB 照射高浓度组(30 mJ/cm2+ C mM 样品)。

2) UVB 老化处理:UVB 辐射前成纤维细胞用 D’Hanks 洗 3 遍,在孔中加入 1 mL D’Hanks,使之浸没细胞,对照组用锡纸包住置暗处。针对试验分组,对需要辐射的组分别进行UVB 造模(每天每次 10 mJ/cm2 共计 3 天连续处理);

3) 给药:按照各试验组分组,每次照射完成后进行给药处理培养 24 h,共计 3 天 3 次;

4)收样:培养结束后,进行细胞收样,提取各实验组总 RNA,合成 cDNA,利用 q-PCR 检测β-actin 和目的基因的基因表达。

5)用β-actin 作为基因表达的内参,计算目的基因的 RNA 相对表达量。

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注:本实验方法中的样品的浓度因实验一结果而定。

【评价指标】

衰老相关分泌表型(SASP)的表达(IL6/TNFα/MMP3。

【评价结论】

与模型对照组相比,实验组中衰老相关分泌表型(SASP)的表达(IL6/TNFα/MMP3)显著性下调(P<0.05),初步证明样品具有抗衰老功效。

【参考文献】

[1]魏丽.柴达木黑果枸杞花青素对 UVB 辐射体外培养人皮肤成纤维细胞的衰老及 p53,p21影响的研究[D].青海大学

[2] Kulms D, Zeise E , P, Ppelmann B , et al. DNA damage, death receptor activation and reactive oxygen species contribute to ultraviolet radiation-induced apoptosis in an essential and independent way.[J]. Oncogene, 2002, 21(38): 5844-5851.

[3] 刘春显,李南.人参皂苷 Rb1 对人体皮肤成纤维细胞衰老的影响[J].人参研究, 2022,34(4):4.

[4] 林勇, 刘硕, 朱华伟,等. 红树莓对 UVB 诱导 HaCaT 光损伤的抑制作用[J]. 湖南农业大学学报(自科版), 2015, 041(005): 474-479.

[5] 冯丹, 刘婷, 李冠汝,等. 蒿秦化斑方对紫外线B诱导的HaCaT细胞光损伤的影响[J]. 环球中医药, 2020, 13(5): 6.


(二)MMP-2 、MMP-9、TIMP-1 和 TIMP-2 的表达

【评价原理】

已有大量的研究证明,紫外线照射后诱导人类皮肤成纤维细胞产生基质金属蛋白酶( MMPs) 增多,MMPs 降解胶原和细胞外基质蛋白,在皮肤光老化中起着重要作用。MMPs是一类含有锌离子、活性依赖于钙离子的蛋白酶,具有广泛的生物学活性。已知的 MMPs 成员有 24 种,主要可分为胶原酶 ( MMP-1,8,13 ) 、基质溶解素( MMP-3,7,10,11) 、明胶酶 ( MMP-2,9) 等亚家族,不同的 MMPs 对细胞外基质不同组分降解的特异性有所不同。人基质金属蛋白酶抑制剂(TIMPs)是 MMPs 天然的特异性内源性抑制剂,TIMPs 与MMPs 的精密平衡在 ECM 的合成和降解中发挥着重要作用,皮肤光老化是二者动态平衡失调的结果。因此,本研究拟用 UVB 辐射成纤维细胞以建立 UVB 所致成纤维细胞 提前衰老模型,通过样品作用于光老化的皮肤成纤维细胞后,检测 MMP-2 、MMP-9、TIMP-1和 TIMP-2 的表达来评价样品的抗衰老功效。

【实验方案】

实验一:MTT 法检测样品对成纤维细胞的细胞毒性实验

实验二:样品对 UVB 老化处理后成纤维细胞的 MMP-2 、MMP-9、TIMP-1 和TIMP-2 表达情况

1) 细胞接种:将成纤维细胞以 2 × 10^5 个/孔接种于 6 孔板,于培养箱(37℃、5%CO2)中培养 12 h,分别设置对照组(X mJ/cm2+0 mM 样品)、UVB 照射低浓度组(30 mJ/cm2+AmM 样品)、UVB 照射中浓度组(30 mJ/cm2 +B mM 样品)、UVB 照射高浓度组(30 mJ/cm2+ C mM 样品)。

2) UVB 老化处理:UVB 辐射前成纤维细胞用 D’Hanks 洗 3 遍,在孔中加入 1 mL D’Hanks,使之浸没细胞,对照组用锡纸包住置暗处。针对试验分组,对需要辐射的组分别进行UVB 造模(每天每次 10 mJ/cm2 共计 3 天连续处理);

3) 给药:按照各试验组分组,每次照射完成后进行给药处理培养 24 h,共计 3 天 3 次;

4)收样:培养结束后,进行细胞收样,提取各实验组总 RNA,合成 cDNA,利用 q-PCR 检测β-actin 和目的基因的基因表达。

5)用β-actin 作为基因表达的内参,计算目的基因的 RNA 相对表达量。

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注:本实验方法中的样品的浓度因实验一结果而定。

【评价指标】

MMP-2 、MMP-9、TIMP-1 和 TIMP-2 相对表达量

【评价结论】

与模型对照组相比,实验组中样品对衰老细胞的基质金属蛋白酶相关基因表达(MMP-2和 MMP-9)显著性下调、而其抑制基因(TIMP-1 和 TIMP-2)显著性上调(P<0.05),初步证明样品具有抗衰老功效。

【参考文献】

[1] 殷珊.栀子黄色素对小鼠B16黑素瘤细胞增殖、酪氨酸酶活性及黑素生成影响的实验研究[D].湖南中医药大学.

[1]魏丽.柴达木黑果枸杞花青素对 UVB 辐射体外培养人皮肤成纤维细胞的衰老及 p53,p21影响的研究[D].青海大学

[2] Kulms D, Zeise E , P, Ppelmann B , et al. DNA damage, death receptor activation andreactive oxygen species contribute to ultraviolet radiation-induced apoptosis in an essential andindependent way.[J]. Oncogene, 2002, 21(38): 5844-5851.

[3] 刘春显,李南.人参皂苷 Rb1 对人体皮肤成纤维细胞衰老的影响[J].人参研究, 2022,34(4):4.

[4] 林勇, 刘硕, 朱华伟,等. 红树莓对 UVB 诱导 HaCaT 光损伤的抑制作用[J]. 湖南农业大学学报(自科版), 2015, 041(005): 474-479.

[5] 冯丹, 刘婷, 李冠汝,等. 蒿秦化斑方对紫外线B诱导的HaCaT细胞光损伤的影响[J]. 环球中医药, 2020, 13(5): 6.

[6]陈巧云,王业秋,陈景华,等.桃叶珊瑚苷对光老化皮肤成纤维细胞 MMP-1 和 TIMP-1 表达的影响[J].中成药, 2014, 36(8):5.

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