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【实验原理】
皮肤是我们身体中最大的器官,具有各种不同的复杂功能。它由三个不同的层组成:表皮、真皮和皮下组织。表皮是皮肤的最外层,作为抵御环境损害的屏障,包括压力、微生物和辐射。此外,表皮也作为机体保湿的重要防线,目前机体保湿程序可以分为被动保湿和主动保湿,两者相互协调共同保障皮肤角质层的水合程度。其中天然保湿因子(NMF)是具有吸水特性的小分子复合物,由透明质酸和丝聚蛋白组成,能够有效吸收并锁住水分,配合防护角质细胞结构,强化锁水屏障。而其中水通道蛋白(AQP3)表达于表皮基底层的角质形成细胞,可以转运水、甘油和尿素到达表皮,促进角质层的水合作用,是维持皮肤水合作用的一个关键因素。综上,本实验拟通过检测样品处理下角质形成细胞中FLG和AQP3基因相对表达量以及HA含量来评价样品否具有保湿功效。
【实验方法】
实验一:MTT法检测样品对HaCaT的细胞毒性实验
1)细胞接种:接种细胞于96孔板内(1 × 10^4个/孔),于37 ℃,5% CO2中培养24 h。
2)给药:样品组加入相应浓度的含样品的培养基,正常对照组更换为新鲜培养基,空白组加入空白培养基,37 ℃,5% CO2孵育24 h。
3)孵育结束后向每孔中加入MTT溶液,继续培养4 h。
4)去培养液,加入DMSO溶液,振荡混匀,测定490 nm处吸光度值。
OD490:490 nm处的吸光度值
实验二:样品处理后HaCaT的FLG和AQP3基因表达
1) 细胞接种:将HaCaT以6 × 10^5个/孔接种于6孔板,于培养箱(37℃、5%CO2)中培养12 h,分别设置对照组(X mJ/cm2+0 mM样品)、低浓度组(X mJ/cm2+A mM样品)、中浓度组(X mJ/cm2+B mM样品)、高浓度组(X mJ/cm2 + C mM样品)。
2)给药:各试验组中分别加入含有不同浓度样品的 DMEM 培养基中继续培养24 h;
3)孵育结束后,D-Hanks轻柔冲洗细胞一次或两次,正常对照组加入新鲜培养基,样品组加入含相应浓度的样品新鲜培养基,37 ℃,5% CO2培养24 h。
4)培养结束后,进行细胞收样,提取各实验组总RNA,合成cDNA,利用q-PCR检测β-actin和目的基因的基因表达。
5)用β-actin作为基因表达的内参,计算目的基因的RNA相对表达量。
实验三:样品处理后HaCaT的HA含量测定
1.细胞接种:接种细胞于12孔板内(3 × 105 个/孔),于37 ℃,5% CO2中培养24 h。
2.给药:样品组加入相应浓度的含样品的培养基,正常对照组更换为新鲜培养基,空白组加入空白培养基,37 ℃,5% CO2孵育24 h。
3.收样检测:孵育结束后,每孔收集300 μL细胞培养上清,ELISA法检测透明质酸含量。
【评价指标】
FLG和AQP3基因表达、HA含量
【评价结论】
与对照组相比,实验组FLG和AQP3基因表达以及HA含量均具有显著性上调且呈现剂量相关性(P<0.05),初步证明样品具有保湿功效。
【参考文献】
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