编者按

知母 (Anemarrhena asphodeloides Bge., AAB) 是一种传统药用植物，在延缓衰老方面有着悠久的历史。然而，其多糖的抗衰老作用尚未得到充分研究。

今天，我们分享2024年12月27日发表在INT J BIOL MACROMOL（IF=7.7）的一项最新研究成果，该研究首次利用斑马鱼、细胞等多种模型探究了知母多糖（AABP）的抗衰老活性，并发现一种葡甘聚糖AABP-1a，为深入研究知母抗衰老机制提供了理论基础。

AABP-1a 的分子量 (MW) 测定为 210.062 kDa，主要由葡萄糖和甘露糖组成，摩尔比约为 4:1。研究表明，AABP-1a 具有抗氧化能力，并能改善由衰老标志物，如 p53、p21、p16 和 SASP介导的细胞周期停滞，减少受损DNA的积累。它能降低斑马鱼体内酸性衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）活性，延长秀丽隐杆线虫的寿命，并减少脂褐素的表达。

文章题目

Structural characterization and anti-aging activity investigation of a polysaccharide from Anemarrhena asphodeloides Bge

杂志：International Journal of Biological Macromolecules（IF=7.7）

发表时间：2024年12月27日

01、研究亮点

• 首次探究了知母多糖 (AABP) 的结构和抗衰老活性，并采用斑马鱼、体外细胞、秀丽隐杆线虫等多种模型系统验证了AABP-1a的抗衰老作用，发现其在多种模型中均表现出优异的抗衰老效果；

• 首次从知母中分离出具有显著抗衰老活性的葡甘聚糖AABP-1a，并通过FT-IR分析、刚果红试验、扫描电子显微镜（SEM）分析、甲基化分析、核磁共振谱分析等多种技术详细表征了其结构；

• 揭示了AABP-1a通过其抗氧化能力、调控细胞周期关键通路，如p53/p21、p16以及抑制 SASP等多重作用机制协同发挥抗衰老效果，为天然、安全、有效的抗衰老候选分子的开发提供了科学依据。

02、研究背景

细胞衰老，即由DNA损伤、端粒缩短或氧化应激等引发的一种细胞周期永久停滞的状态，现已成为生物学和老年医学领域的核心议题。近年来，科学界对揭示细胞衰老机制的关注度日益提升。值得注意的是，细胞停止分裂与释放衰老相关分泌表型(SASP)密切相关，SASP表型可能会通过影响周围组织来促进衰老相关疾病的发生。

在抗衰老领域，尽管已开发出二甲双胍、雷帕霉素和β-烟酰胺单核苷酸（NMN）等合成化合物用于延缓衰老及预防相关疾病，但其长期使用可能伴随着肝毒性、视网膜功能障碍等副作用。因此，对安全有效的天然抗氧化剂的需求日益增长，以延缓衰老并降低衰老相关疾病风险的发生。

生物活性多糖因其在免疫调节、抑制肿瘤生长、抗病毒、降低氧化应激水平、降血糖等方面的治疗特性，已成为全球研究热点，尤其是多糖的抗衰老作用，引起全球学者的广泛关注。研究表明，多种植物多糖具有显著的抗衰老作用，其中具有突出抗衰老功效的葡甘露聚糖成为了重点研究对象。

本研究以百合科植物知母（AAB）为研究对象，其广泛分布于中国，以清热泻火、滋阴润燥的功效而著称。知母富含甾体皂苷、生物碱、双苯吡酮、木脂素、多糖、氨基酸、挥发油等多种成分，其中多糖约占其根茎成分的30%。尽管知母中的皂苷相关药理研究备受关注，但其多糖的结构与药理潜力尚未被充分挖掘。

本研究中，研究人员首次从知母中分离纯化出抗衰老成分——葡甘聚糖AABP-1a，全面阐明了其结构，并通过斑马鱼、细胞、秀丽隐杆线虫等多种模型系统验证了AABP-1a的抗衰老作用，初步阐明了AABP-1a的抗衰老机制，表明其通过抗氧化与细胞周期调节等协同发挥抗衰老作用，为AABP-1a在抗衰老领域的产品开发与应用提供了理论基础。

研究结果显示，AABP-1a的分子量 (MW) 为210.062kDa，主要由葡萄糖和甘露糖组成，其摩尔比约为4:1。AABP-1a 的主链主要由→4)-2Ac-\β-Man(1→ 和→4)-\β-Glc(1→ 以及少量支链→4,6)-\β-Glc(1→和→3,4)-\β-Glc(1→构成，支链部分由→6)-\β-Glc(1→ 和 t-\α-Glc(1→ 组成。AABP-1a 具有抗氧化能力，并能改善由衰老标志，如p53、p21、p16 和 SASP介导的细胞周期停滞，减少受损DNA的积累。此外，它能降低斑马鱼体内SA-\β-Gal的活性，延长秀丽隐杆线虫的寿命并减少脂褐素 (lipofuscin) 的表达。

03、研究结果

1. 多糖的提取、纯化、分馏及单糖组成

知母通过水提和初步纯化，获得12.31%的多糖（AABP）。从AABP中分离得到中性多糖(AABP-1)及3种酸性多糖，AABP-1的回收率为33.14%。随后，进一步纯化中性多糖AABP-1，获得2种中性多糖AABP-1a和AABP-1b。使用AABP-1a(210.062kDa)来表征其结构并分析其生物活性，并通过BCA法定量检测AABP-1a的蛋白含量极低，仅有0.27%。采用间羟基联苯法测定AABP-1a不含酸性多糖。

单糖组成分析表明，AABP-1a由甘露糖(Man)和葡萄糖(Glc)组成，其摩尔比为4:1，这表明AABP-1a是一种葡甘聚糖，而甘露糖是构成AABP-1a的主要单糖。

图1

2. AABP-1a的结构表征

研究人员首次通过FT-IR分析、刚果红实验、扫描电子显微镜（SEM）分析、甲基化分析、核磁共振谱分析等多种技术详细阐明了AABP-1a的精细结构。多种技术分析显示，AABP-1a 的主链主要由O-乙酰化的→4)-\β-Manp-(1→和→4)-\β-Glcp-(1→ 组成；支链包含少量 →4,6)-\β-Glcp-(1→ 和 →3,4)-\β-Glcp-(1→；支链末端由 →6)-\β-Glcp-(1→ 和 t-\α-Glcp-(1→ 构成。

刚果红实验证实，随着NaOH溶液的浓度从0升高到0.4摩尔/升，AABP-1a可观测到整个光谱范围内的红移现象，这表明AABP-1a具有稳定的三重螺结构表征。SEM分析显示，在5000x的放大倍率下，其具有疏松多孔的纤维状形态。

图2

3. AABP-1a在体外的抗氧化活性

自由基，又称游离基，由单个不配对电子的原子、分子、离子或基团组成，被认为是细胞衰老的关键因素。它们的高反应性可以与细胞成分，如DNA、脂质和其他分子等相互作用，引起氧化损伤并促进多种疾病的发生。具有较高自由基清除率的化合物有望延缓细胞及组织的衰老。

研究表明，AABP-1a具有强大的自由基清除能力，且AABP-1a在特定浓度范围内，对DPPH和羟自由基的清除效率与浓度有关。值得注意的是，在10mg/mL的浓度下，AABP-1a对DPPH自由基的清除率为54.92%，对羟自由基的清除率为67.72%，这表明它具有显著的抗氧化特性。

4. 斑马鱼揭示AABP-1a对SASP、SA-β-gal及细胞周期分布的影响

衰老相关分泌表型(SASP)，即细胞在衰老过程中呈现的一种与年龄相关的分泌表型。随着细胞老化，会生成种类繁多的细胞因子、细胞外基质成分及其他生物活性分子，这些分子在调节细胞环境、参与与邻近细胞、免疫细胞和内皮细胞的相互作用中起着重要的作用，从而影响周围组织的功能和状态。为了研究AABP-1a 对常见 SASP 事实的潜在影响，研究人员采用qRT-PCR实验检测了IL-6、IL-1B、MMP3、EMGB1和 RANTES的MRNA表达。结果表明，AABP-1a可以在斑马鱼抗衰老模型中显著逆转SASP的表达(p<0.05)，AABP-1a可能具有抗炎特性、减缓衰老相关过程、增强细胞微环境等多种作用，并可能在减缓与衰老相关的变化、提升机体整体健康水平和功能方面起到一定作用。

图3

SA-β-gal在细胞衰老过程中起着关键作用，其常与SA-β-gal活性增加有关。作为细胞衰老的经典指标，它被用来表征细胞的衰老状态。研究中，SA-β-gal表达的显著升高表明斑马鱼抗衰老模型的成功建立。采用不同浓度的AABP-1a进行处理后，SA-β-gal表达的指数显著降低(p<0.001)。为了进一步验证实验结果的可信度，研究人员还研究了斑马鱼抗衰老模型中，AABP-1a对SA-β-gal染色的影响。结果显示，这些指标的趋势与细胞模型中观察到的趋势完全一致(图3G、I)，这进一步证实了AABP-1a的抗衰老作用。

细胞老化的一个显著特征是细胞周期停滞。当生长停止时，由于显性细胞周期抑制剂的表达，细胞无法启动DNA复制。在本研究中，研究人员探究了AABP-1a对细胞周期的影响。结果显示，79.4%的H_2 O_2诱导的人脐静脉内皮细胞（HUVECs）处于G0/G1期，而只有7.57%处于S期。相比之下，未处理的细胞中G0/G1期和S期的比例分别为55.48%和30.8%，这表明HUVECs的细胞周期停滞在G0/G1期。AABP-1a预处理显著降低了G0/G1期细胞的比例，M剂量66.6%(图3H)，由此可以推测AABP-1a可能通过改善周期阻滞来达到抗衰老效果。

5. AABP-1a对秀丽隐杆线虫的影响

随着细胞老化，寿命是线虫老化过程中最直观的评价指标。研究人员探究了不同剂量的AABP-1a对秀丽隐杆线虫寿命的影响。结果显示，在500ug/mL浓度下，AABP-1a可使秀丽线虫的存活率提高8.69%(图4A)。实验期间处理组的线虫繁殖能力、咽泵频率和身体弯曲次数与对照组无显著差异，这表明，AABP-1a处理组保持正常的健康状态，AABP-1a具有安全性及潜在的抗衰老作用。

抗氧化剂和氧化应激途径可能导致线虫寿命缩短，热应激还可能导致线虫的寿命缩短。随后，研究人员在热应激和氧化应激条件下，评估了AABP-1a对线虫存活率的影响。实验表明，AABP-1a在热应激条件下对线虫存活率无显著影响，但在氧化应激条件下，则可以显著延长线虫的寿命。

脂褐质，是细胞氧化的产物，也是衰老的关键标志物，其积累水平在秀丽隐杆线虫中可以被检测到。实验结果表明，低、中、高浓度的AABP-1a处理组均显著降低线虫体内的脂褐素水平（p < 0.05）。

图4

6. AABP-1a对p53/p21、p16信号通路的影响

由于AABP-1a能够通过促进细胞周期停滞来表现其抗衰老效果，研究人员进一步探究了AABP-1a如何影响细胞周期。p53是一种重要的肿瘤抑制蛋白，当细胞遭受DNA损伤或其他压力时会被激活，激活的p53可以通过多种途径来调节细胞周期，p53可以直接促进p21的表达。p21则是一种细胞周期抑制蛋白，能抑制细胞周期蛋白激酶CDK的活性，阻止细胞进入S期及G2/M期，从而导致细胞周期停滞，并抑制细胞增殖。p16，也称为CDKN2A，是另一种重要的细胞周期抑制蛋白，通过抑制CDK4和CDK6的活性来阻止细胞进入S期和G2/M期。p16通常在细胞衰老和肿瘤抑制中发挥作用，其异常表达与多种细胞中异常生长的发生和进展密切相关。

细胞及斑马鱼衰老模型的实验结果显示，与对照组相比，模型组p53/p21和p16的mRNA表达水平显著升高(p<0.001)，而采用高、中、低浓度的AABP-1a进行处理后，与模型组相比，p53/p21和p16的mRNA表达水平则显著降低(p<0.001)。因此，可以初步推断AABP-1a可能通过p53/p21及p16信号通路影响细胞周期，从而发挥抗衰老作用。

图5

04、编者点评

本研究首次从知母中分离出具有显著抗衰老活性的葡甘聚糖AABP-1a，并详细表征了其结构。AABP-1a 在细胞、线虫和斑马鱼多种模型中均表现出优异的抗衰老效果，如延长寿命、减轻氧化损伤、改善细胞周期停滞、抑制衰老相关分泌表型和降低衰老标志物水平等，其作用机制涉及抗氧化、调控p53/p21和p16信号通路等多方面。该研究不仅丰富了天然多糖抗衰老的理论基础，也为开发基于知母多糖的新型抗衰老产品提供了重要依据，未来的研究将聚焦于深入阐明其作用靶点及构效关系。

作为健康美丽产业CRO服务开拓者与引领者、斑马鱼生物技术的全球领导者，环特生物搭建了“斑马鱼、类器官、哺乳动物、人体”多维生物技术服务体系，开展健康美丽CRO服务、科研服务、智慧实验室搭建三大业务。目前，环特已建立200多种斑马鱼模型，胃癌、脑类器官、心脏类器官及各种肿瘤类器官培养平台，欢迎有需要的读者垂询！