皮肤外植体评价样品抵抗光损伤作用

【实验原理】

皮肤作为人体最大的器官，在抵御外界环境压力方面起着至关重要的作用。皮肤光损伤是指由于光线强度或光照时间超过皮肤的承受能力，导致的皮肤组织损伤。紫外线辐射是造成皮肤光损伤和光老化的主要因素，长期暴露于紫外线中还会导致皮肤ECM降解、DEJ功能紊乱、胶原蛋白和弹性蛋白减少、MMPs分泌增多等。紫外线导致的光损伤还表现为皮肤屏障受损、色素沉着等。此外，紫外线还可以通过氧化应激反应、DNA损伤、炎症反应和免疫抑制等机制引起皮肤光损伤。

因此，可采用紫外线照射皮肤外植体造模，通过检测样品作用后皮肤外植体后的组织形态、屏障蛋白LOR、增殖标志物Ki67、DNA损伤标志物γ-H2AX、活性氧ROS、细胞外基质的主要成分、炎症因子等指标，从多个维度评价待测样品的抵抗光损伤作用。

【评价指标】

1、组织形态

2、胶原纤维

3、屏障蛋白LOR

4、增殖标志物Ki67

5、DNA损伤标志物γ-H2AX

6、I型、III型、IV型胶原蛋白

7、活性氧ROS

8、炎症因子TNF-α、IL-1α、IL-6、IL-8

【实验方案】

1、皮肤外植体组织形态、胶原纤维检测方案：

皮肤外植体获取与消毒——皮肤外植体无菌培养——紫外照射及加药处理（空白对照组：不处理；模型对照组：紫外照射；样品组：紫外照射+待测样品处理）——组织固定——石蜡包埋——切片——H&E染色、Masson染色——显微镜拍照及分析

2、皮肤外植体屏障蛋白LOR、增殖标志物Ki67、DNA损伤标志物γ-H2AX检测方案：

皮肤外植体获取与消毒——皮肤外植体无菌培养——紫外照射及加药处理（空白对照组：不处理；模型对照组：紫外照射；样品组：紫外照射+待测样品处理）——OCT包埋——冷冻切片——LOR、Ki67、γ-H2AX免疫荧光染色——荧光显微镜拍照及分析

3、皮肤外植体I型胶原蛋白、III型胶原蛋白、IV型胶原蛋白检测方案：

皮肤外植体获取与消毒——皮肤外植体无菌培养——紫外照射及加药处理（空白对照组：不处理；模型对照组：紫外照射；样品组：紫外照射+待测样品处理）——OCT包埋——冷冻切片——I型、III型、IV型胶原蛋白免疫荧光染色——荧光显微镜拍照及分析

4、皮肤外植体ROS检测方案：

皮肤外植体获取与消毒——皮肤外植体无菌培养——紫外照射及加药处理（空白对照组：不处理；模型对照组：紫外照射；样品组：紫外照射+待测样品处理）——OCT包埋——冷冻切片——ROS荧光探针染色——荧光显微镜拍照及分析

5、皮肤外植体炎症因子检测方案

皮肤外植体获取与消毒——皮肤外植体无菌培养——紫外照射及加药处理（空白对照组：不处理；模型对照组：紫外照射；样品组：紫外照射+待测样品处理）——收样——ELISA——酶标仪检测——结果分析

【结果展示】

图1 组织形态染色典型图

图2  胶原纤维染色典型图

图3  LOR荧光染色典型图

图4  Ki67荧光染色典型图

图5  I型胶原蛋白免疫荧光染色典型图

图6  ROS荧光染色典型图

图7 炎症因子ELISA检测典型图

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