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项目一：细胞活性保护比率
【实验原理】
蓝光波长比紫外线长，具有较强的穿透力，能够穿透皮肤表皮抵达真皮层,引起一系列的炎症反应和线粒体损伤，最终诱导细胞的凋亡甚至肿瘤的发生。采用蓝光光源照射人永生化角质形成细胞HaCaT，会出现一定的细胞毒性，抑制细胞增殖。计算添加和不添加样品对于细胞的保护比率，以此评价样品是否具有蓝光防护功效。
【实验步骤】
实验一：MTT法检测某化妆品对HaCaT的细胞毒性实验
1）细胞接种：接种细胞于96孔板内（1×10^4 个/孔），于37 ℃，5% CO2中培养24 h。
2）给药：样品组加入相应浓度的含样品的培养基，正常对照组更换为新鲜培养基，空白组加入空白培养基，37 ℃，5% CO2孵育24 h。
3）孵育结束后向每孔中加入MTT溶液，继续培养4 h。
4）去培养液，加入DMSO溶液，振荡混匀，测定490 nm处吸光度值。
OD490：490 nm处的吸光度值
实验二：MTT法检测某化妆品抗蓝光保护
1）细胞接种：准备2块96孔板，将HaCaT细胞以1×10^4的密度接种于96孔板中，于37 ℃，5%CO2培养箱中培养24 h。1号板设置为未添加样品的非光照组，2号板设置为未添加样品的光照组（模型组）和添加样品的光照组。
2）给药：细胞培养24 h后，取出2号板，加样品处理，另设空白对照（无细胞+完全培养基）,然后将2块板放入37 ℃，5%CO2培养箱中培养1 h。
3）造模：将2号板放入蓝光暗箱里照射3 h，1号板继续在37 ℃培养箱避光培养3 h。
4）收样检测：照射结束后，MTT法测定490 nm处吸光度值。根据OD值计算细胞活性保护比率（A）。
式中：
A：细胞活性保护比率；
CV：细胞活力值；
CVd1：添加样品的光照组细胞的细胞活力值；
CVe1：未添加样品的光照组细胞的细胞活力值；
CVe0：未添加样品的非光照组细胞的细胞活力值；
【评价指标】保护比率（A）
【评价结论】A ≥ 1.5，判定为样品在该浓度下具有蓝光防护能力。
【参考文献】
[1] GB/T 38120-2019,蓝光防护膜的光健康与光安全应用技术要求[S].
[2] 夏艾婷.叶黄素对蓝光诱导皮肤成纤维细胞损伤的保护作用及其机制的研究[D].安徽医科大学.
项目二：ROS清除率
【实验原理】
皮肤位于人体的最外层，保护我们免受各种外部因素的影响，包括阳光、污染物和压力。阳光是影响皮肤的最大因素之一，主要由紫外线(UV)、可见光和红外光组成，具体取决于能量和波长。在各种波长中，由于智能手机、笔记本电脑、电脑和电视等电子设备在日常生活中的广泛使用，蓝光(380-500纳米)，也称为高能可见光，尤其受到关注。据报道，过度暴露于蓝光会对皮肤细胞造成多种损伤，包括氧化应激、细胞凋亡和增殖能力下降等。。因此，本实验拟检测ROS清除率，以此维度判断样品是否具有抗蓝光保护作用。
【实验方法】
实验一：MTT法检测某化妆品对HaCaT的细胞毒性实验
1）细胞接种：接种细胞于96孔板内（1×10^4 个/孔），于37 ℃，5% CO2中培养24 h。
2）给药：样品组加入相应浓度的含样品的培养基，正常对照组更换为新鲜培养基，空白组加入空白培养基，37 ℃，5% CO2孵育24 h。
3）孵育结束后向每孔中加入MTT溶液，继续培养4 h。
4）去培养液，加入DMSO溶液，振荡混匀，测定490 nm处吸光度值。
OD490：490 nm处的吸光度值
实验二：样品对蓝光辐射后HaCaT的ROS清除效率
1) 细胞接种：将HaCaT以2 × 10^4个/孔接种于96孔板，于培养箱（37℃、5%CO2）中培养12 h，分别设置正常对照组（0 mM样品）、模型对照组（蓝光辐射3 h+0 mM样品）、低浓度组（蓝光辐射3 h+A mM样品）、中浓度组（蓝光辐射2 h+B mM样品）、高浓度组（蓝光辐射3 h + C mM样品）。
2) 给药预处理：各试验组中分别加入含有不同浓度样品的 DMEM 培养基中预培养24 h；
3) 蓝光造模：蓝光辐射前HaCaT用D’Hanks洗3遍，在孔中加入 50 ul D’Hanks，使之浸没细胞，对照组用锡纸包住置暗处。针对试验分组，对需要辐射的组分别进行蓝光造模 3 h；
4) 给药：各试验组中分别加入含有不同浓度样品的 DMEM 培养基中继续培养24 h；
5) ROS荧光探针转载：按照1:1000的稀释比例，采用PBS稀释DCFH-DA至终浓度为10 μmol/L。除裸细胞孔外，弃掉其余孔中的培养基，用PBS清洗3次后，每孔加入200 ul DCFH-DA工作液，CO2培养箱孵育30 min，孵育结束后，PBS清洗各孔内细胞3次；
6） 荧光分析。将待测96孔板置于荧光酶标仪检测台上，设置入射光波长525 nm，激发光波长488 nm，读数分析。
7） 计算。根据各组实验荧光强度，计算样品对ROS的清除效率。
注：本实验方法中的样品的浓度和辐射剂量因实验一而定。
【评价指标】ROS清除率
【评价结论】
与模型对照组相比，实验组中样品对ROS的清除率具有显著性上调且呈现剂量相关性（P＜0.05），初步证明样品具有抗蓝光保护作用。
【参考文献】
[1]Park JY, Park SH, Oh SW, et al. Yellow Chaste Weed and Its Components, Apigenin and Galangin, Affect Proliferation and Oxidative Stress in Blue Light-Irradiated HaCaT Cells[J].Nutrients. 2022 ,14(6):1217.
[2]Hao W, Zhao C, Li G, et al. Blue LED light induces cytotoxicity via ROS production and mitochondrial damage in bovine subcutaneous preadipocytes[J] Environ Pollut. 2023,322:121195.
[3]郭砚, 孙娟, 王丽雯. 藏雪莲水提取物对中波红斑效应紫外线辐射后人角质形成细胞中蛋白表达的影响研究[J]. 中国全科医学, 2015(24): 2929-2933.
[4] Kulms D, Zeise E , P, Ppelmann B , et al. DNA damage, death receptor activation and reactive oxygen species contribute to ultraviolet radiation-induced apoptosis in an essential and independent way.[J]. Oncogene, 2002, 21(38): 5844-5851.
[5] Ko H J , Kim J , Ahn M , et al. Ergothioneine alleviates senescence of fibroblasts induced by UVB damage of keratinocytes via activation of the Nrf2/HO-1 pathway and HSP70 in keratinocytes[J]. Experimental Cell Research, 2021, 400(1): 112516.
[6] 林勇, 刘硕, 朱华伟,等. 红树莓对UVB诱导HaCaT光损伤的抑制作用[J]. 湖南农业大学学报(自科版), 2015, 041(005): 474-479.
[7] 冯丹, 刘婷, 李冠汝,等. 蒿秦化斑方对紫外线B诱导的HaCaT细胞光损伤的影响[J]. 环球中医药, 2020, 13(5): 6.
