编者按：母体免疫激活常导致新生儿罹患儿童自闭症谱系障碍等神经发育缺陷疾病，相关的研究往往运用动物模型，易受种间差异性的影响。人多能干细胞（iPSC）来源的人脑类器官技术在脑发育相关研究中已取得一定进展。那么，能否利用人脑类器官研究母体免疫激活呢？如何验证疾病模型的诱导效果并解释内在的机制呢？

今天我们特别关注一项于2023年3月6日发表在《自然·分子精神病学》的最新研究——《Human brain organoid model of maternal immune activation identifies radial glia cells as selectively vulnerable》，该研究在人脑类器官上诱导出母体免疫激活疾病模型，并从多个角度验证了造模的效果，最后在细胞和分子机制上研究了内在的机理。

一、研究背景

流行病学调查研究显示，孕期母体的健康状况对新生儿的发育影响较大[1-3]。其中，孕期病毒性或者细菌性的感染会导致母体细胞因子和趋化因子分泌增加，通过胎盘转移或者诱导胎盘炎症，从而增大胎儿发育环境中这些免疫介质的浓度，进而严重影响新生儿的神经发育。这就是母体免疫激活（maternal immune activation, MIA）所导致人类神经发育缺陷病，例如儿童自闭症谱系障碍（autism spectrum disorder, ASD）。

鉴于近几年新冠肺炎（COVID-19）等公共卫生事件频发，MIA相关的疾病研究正越来越受到关注。据报道，在多种MIA动物模型中，都能观察到人类ASD症状相关的行为缺陷表型[4-8]。但运用这些MIA动物模型进行的人类疾病研究，又往往受制于动物实验的可变性以及种间差异性[9,10]。人诱导多能干细胞（human induced pluripotent stem cell, iPSC）来源的人脑类器官为研究逆境对生命早期人脑发育的影响提供了新的途径。

作者在体外构建了人iPSC来源的背侧前脑类器官（dorsal forebrain organoids, DFOs），以模拟胎儿的脑部发育情况，并通过Hyper-IL-6（促炎症细胞因子白介素6（interleukin 6, IL-6）和其受体s-IL6R的嵌合蛋白）的暴露诱导建立了MIA的疾病模型，并对MIA导致的ASD等疾病风险增加的细胞和分子机制进行了研究。

原文图1 人妊娠中期新皮质和背侧前脑类器官中IL-6信号通路的特征

原文图2 Hyper-IL-6处理级联激活细胞内JAK/STAT通路，并改变背侧前脑类器官的转录情况

二、研究结果

1. MIA疾病模型造模效果的验证

文献报道孕期IL-6的浓度升高与新生儿大脑结构和功能的改变相关[11-13]，在动物模型中，IL-6可在雄性后代中诱导出类似人ASD疾病行为学症状[14,15]。IL-6需要与其受体IL6R和另一信号转导蛋白IL6ST形成复合体才能激活转录。

本文作者通过Hyper-IL-6处理脑类器官来造模，所以首先需要在分子机制上确定脑类器官可表达IL6ST。文献报道胎儿脑新皮质细胞类型中的放射状胶质细胞（radial glia, RG）可表达IL6ST[16]，作者通过免疫荧光，用Nestin标记RG，同时共标记IL6ST，在类器官中鉴定出RG细胞类型和IL6ST，且二者相关性强，从而证实了脑类器官对Hyper-IL-6的响应（原文图1）。

在可响应性的基础上，作者通过Western-Blot检测到下游信号传导相关蛋白质磷酸化水平升高，验证了下游信号级联的激活。作者进一步验证下游信号激活后，相关转录事件的发生。通过检测Hyper-IL-6处理后脑类器官的差异化表达基因。并通过富集分析，将差异化表达基因归类到与先天免疫反应和JAK/STAT通路相关的生物学过程，以及分析出RGs可能是最容易受到Hyper-IL-6影响的细胞类型，这也和IL6ST表达在RGs中的表达模式互为印证（原文图2）。

原文图3 Hyper-IL-6处理使得背侧前脑类器官的细胞类型组成产生细微变化。

2. MIA脑类器官疾病模型表现出轻微的细胞结构变化

在小鼠胚胎MIA模型中（E12.5），增殖性细胞分裂和神经源性细胞分裂的比例出现变化，最终导致发育后期深层兴奋性神经元（deep-layer Exciatory Neuros, dExN）过度产生[15]。

作者通过免疫组化来研究脑类器官疾病模型在形态和组成细胞类型的变化，尤其是易受Hyper-IL-6影响的RGs的变化，结果显示模型组脑室区类似区域SOX2+的细胞（具有干性）数量增加，而其中一种类型细胞，TBR2+的中间祖细胞（Intermediate progenitor cells, IPCs）数量不变，说明Hyper-IL-6特异性靶向脑室区的RGs（vRGs）。

这种不同类型细胞比例的变化与鼠MIA疾病模型类似。作者还用CTIP2标记dExN，用SATB2标记上层兴奋性神经元（upper-layer Exciatory Neurons, uExN），发现虽然Hyper-IL-6处理前后dExN的数量未见显著差异，但uExN数量显著增加，且分析二者沿皮质层类似区域的分布显示，二者相对表达的位置有轻微的差异，这种异常提示神经元迁移或成熟缺陷，这些缺陷也在MIA疾病的脑解剖观察中也存在（原文图3）。

原文图5 Hyper-IL-6处理后单细胞差异表达基因及转录网络的变化

原文图6 Hyper-IL-6处理后背侧前脑类器官在细胞、分子层面的变化示意图

3. 单细胞RNA测序揭示了MIA疾病模型脑类器官中细胞类型的特异性改变

作者推测，脑类器官中的RGs中可能会对Hyper-IL-6产生细胞特异性应答。通过单细胞RNA测序，发现Hyper-IL-6处理会导致兴奋性谱系神经元向早期祖细胞类型转变，进一步通过差异化表达基因和富集分析，揭示了Hyper-IL-6诱导的细胞类型特异性转录改变主要包括：免疫反应相关基因的上调和vRGs蛋白翻译相关基因的下调，这与之前的动物和体外MIA模型上观察到的结果一致。

此外，作者还在脑类器官的MIA模型中发现了在动物MIA模型研究中未见报道的差异化表达基因，主要是NR2F1。作者推测这可能是人的物种特异性的影响，可能与人类流行病学研究特别相关，所以进一步说明该MIA人脑类器官模型是对过往MIA模型的必要扩展。

三、编者点评：

该文提供了一种正常类器官运用的新思路，即利用疾病造模方法诱导出相关的类器官疾病模型，可能可以在一定程度上克服动物模型与人体之间的物种特异性问题，是对动物疾病模型的必要补充。

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参考资料：

[1] [Chan EY, Olson LC, Kisthard JA, et al. Ischemic cholangiopathy following liver transplantation from donation after cardiac death donors. Liver Transpl. 2008; 14: 604–610.

[2] Nakanuma Y. Tutorial review for understanding of cholangiopathy. Int J Hepatol. 2012; 2012: 1–9.

[3] Deltenre P, Valla D-C. Ischemic cholangiopathy. Semin Liver Dis. 2008; 28: 235–246

[4] Shi S, Verstegen MMA, Roest HP, et al. Recapitulating cholangiopathy-associated necroptotic cell death in vitro using human cholangiocyte organoids. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 2022; 13: 541–564.

[5] Verstegen MMA, Roos FJM, Burka K, et al. Human extrahepatic and intrahepatic cholangiocyte organoids show region-specific differentiation potential and model cystic fibrosis-related bile duct disease. Sci Rep. 2020; 10: 21900

[6] Huch M, Gehart H, van Boxtel R, et al. Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver. Cell. 2015; 160: 299–312.